mRNA बूस्टर टीकाकरण वृद्ध चूहों को SARS-CoV-2 Omicron प्रकार से बचाता है

जानवरों

जैक्सन प्रयोगशाला से महिला, 3 महीने की BALB / c चूहों को खरीदा गया था। मादा, 11-महीने की BALB/c चूहों को टैकोनिक बायोसाइंसेस से खरीदा गया और वृद्ध चूहों के प्रयोगों के लिए उपयोग किया गया। बोस्टन चिल्ड्रेन हॉस्पिटल में विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त परिस्थितियों में चूहे रखे गए थे। सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के तहत अनुमोदित किया गया था और बच्चों के अस्पताल में पशु संसाधन विभाग (प्रोटोकॉल नंबर 19-02-3897 R) की देखरेख में संचालित किया गया था। यूनिवर्सिटी ऑफ मैरीलैंड स्कूल ऑफ मेडिसिन में, चूहों को IACUC (प्रोटोकॉल #1120004) के तहत अनुमोदित सभी प्रक्रियाओं के साथ SARS-CoV-2 संक्रमण के लिए जैव सुरक्षा स्तर 3 सुविधा में रखा गया था।

प्रतिरक्षा

चूहों को BNT162b2 SARS-CoV-2 स्पाइक mRNA वैक्सीन (फाइजर-बायोएनटेक) के साथ इंजेक्शन लगाया गया था। BNT162b2 निलंबन (एमआरएनए/एमएल का 100 माइक्रोग्राम) फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में 1:5 पतला था और 50 μL (1 माइक्रोग्राम) दुम जांघ में इंट्रामस्क्युलर रूप से इंजेक्ट किया गया था। BNT162b2 को बोस्टन चिल्ड्रन्स हॉस्पिटल वैक्सीन क्लिनिक से उपयोग की गई शीशियों में अवशिष्ट ओवरफिल वॉल्यूम के रूप में प्राप्त किया गया था, केवल उस सामग्री का उपयोग करके जिसे अन्यथा त्याग दिया जाएगा, और पुनर्गठन के समय से 6 घंटे के भीतर उपयोग किया गया था। नकली उपचार चूहों ने अकेले पीबीएस प्राप्त किया।

SARS-CoV-2 वाइल्डटाइप स्पाइक और RBD एक्सप्रेशन और शुद्धिकरण

पूर्ण लंबाई SARS-CoV-2 वुहान-हू-1 स्पाइक ग्लाइकोप्रोटीन (M1-Q1208, जेनबैंक MN90894) और RBD निर्माण (एमिनो एसिड अवशेष R319-K529, जेनबैंक MN975262.1), दोनों एक HRV3C प्रोटीज क्लीवेज साइट, एक ट्विनस्ट्रेपटैग और सी-टर्मिनस पर एक 8XHisTag क्रमशः बार्नी एस। ग्राहम (एनआईएच वैक्सीन रिसर्च सेंटर) और आरोन जी। श्मिट (रैगन इंस्टीट्यूट) से प्राप्त किया गया था। इन स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर का उपयोग पॉलीएथिलीनिमाइन (पॉलीसाइंसेस) का उपयोग करके Expi293F निलंबन कोशिकाओं (थर्मो फिशर) को संक्रमित करने के लिए किया गया था। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 8% सीओ . में बढ़ने दिया गया2 शुद्धिकरण के लिए कटाई से पहले अतिरिक्त 5 दिनों के लिए। स्ट्रेप्टैक्टिन राल (आईबीए) या कोबाल्ट-टैलोन राल (तकरा) का उपयोग करके फ़िल्टर किए गए सतह पर तैरनेवाला से पीबीएस बफर (पीएच 7.4) में प्रोटीन को शुद्ध किया गया था। एफ़िनिटी टैग को एचआरवी 3सी प्रोटीज़ द्वारा एलुटेड प्रोटीन नमूनों से हटा दिया गया था, और टैग हटाए गए प्रोटीन को आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी द्वारा पूर्ण लंबाई स्पाइक के लिए सुपरोज़ 6 10/300 कॉलम (साइटिवा) और एक सुपरडेक्स 75 10/300 वृद्धि कॉलम का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। (Cytiva) एक पीबीएस बफर (पीएच 7.4) में आरबीडी डोमेन के लिए।

एलिसा

पहले वर्णित प्रोटोकॉल के संशोधन द्वारा एलिसा द्वारा सीरम नमूनों में स्पाइक प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी सांद्रता की मात्रा निर्धारित की गई थी28. संक्षेप में, हाई-बाइंडिंग फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट्स (कॉर्निंग) को स्पाइक प्रोटीन (25 एनजी प्रति कुएं) के साथ लेपित किया गया था और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया गया था। प्लेट्स को 0.05% ट्वीन 20 / पीबीएस से धोया गया और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) / पीबीएस के साथ अवरुद्ध किया गया। सीरम के नमूनों को क्रमिक रूप से 1:100 से 1:1.05 × 10 . तक चार गुना पतला किया गया था8 और फिर कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। प्लेट्स को तीन बार धोया गया और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (HRP) -कंजरेबल एंटी-माउस IgG, IgG1, और IgG2a (सदर्नबायोटेक) के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। प्लेट्स को पांच बार धोया गया और 5 मिनट के लिए टेट्रामेथिलबेंज़िडाइन (BD OptEIA Substrate Solution, BD Biosciences) के साथ विकसित किया गया और फिर 2 NH के साथ बंद कर दिया गया।2इसलिए4. स्पेक्ट्रामैक्स iD3 माइक्रोप्लेट रीडर (आणविक उपकरण) के साथ ऑप्टिकल घनत्व (ODs) को 450 एनएम पर पढ़ा गया था। एंडपॉइंट टाइटर्स की गणना कमजोर पड़ने के रूप में की गई थी जो एक ओडी को 3x पृष्ठभूमि से अधिक उत्सर्जित करता था। पता लगाने की सीमा से कम आयुध डिपो मूल्यों वाले नमूनों को 50 का एक मनमाना मूल्य सौंपा गया था, जिसके लिए अनुमापांक को प्रक्षेपित करना संभव नहीं था।

hACE2-RBD निषेध परख

hACE2-RBD निषेध परख ने पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के संशोधन का उपयोग किया29. संक्षेप में, हाई-बाइंडिंग फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट्स (कॉर्निंग) को पीबीएस में पुनः संयोजक hACE2 (100 एनजी प्रति कुएं) (सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ लेपित किया गया था, 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ऊष्मायन किया गया था, 0.05% ट्वीन 20 पीबीएस के साथ तीन बार धोया गया था। , और आरटी पर 1 घंटे के लिए 1% बीएसए पीबीएस के साथ अवरुद्ध। सीरम के नमूनों को 1:160 पतला किया गया था, आरटी पर 1 घंटे के लिए 1% बीएसए पीबीएस में 3 एनजी वाइल्डटाइप आरबीडी-एफसी के साथ पूर्वनिर्मित किया गया था, और फिर एचएसीई 2-लेपित प्लेट में स्थानांतरित कर दिया गया था। सीरम नमूनों के साथ प्रीइंक्यूबेशन के बिना आरबीडी-एफसी को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में जोड़ा गया था, और सीरम प्रीइंक्यूबेशन के बिना 1% बीएसए पीबीएस को नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जोड़ा गया था। प्लेट्स को तीन बार धोया गया और आरटी पर 1 घंटे के लिए एचआरपी-संयुग्मित मानव-विरोधी आईजीजी एफसी (सदर्नबायोटेक) के साथ जोड़ा गया। प्लेटों को पांच बार धोया गया और 5 मिनट के लिए टेट्रामेथिलबेंज़िडाइन (BD OptEIA Substrate Solution, BD Biosciences) के साथ विकसित किया गया और फिर 2 NH के साथ बंद कर दिया गया।2इसलिए4. OD को स्पेक्ट्रामैक्स iD3 माइक्रोप्लेट रीडर (आणविक उपकरण) के साथ 450 एनएम पर पढ़ा गया था। HACE2 के लिए RBD बाइंडिंग के प्रतिशत अवरोध की गणना इस प्रकार की गई: निषेध (%) =[1 − (Sample OD value − Negative Control OD value)/(Positive Control OD value − Negative Control OD value)]× 100.

स्यूडोवायरस न्यूट्रलाइजेशन परख

SARS-CoV-2 स्यूडोवायरस एक लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर जीन को व्यक्त करने वाले दृष्टिकोण के समान उत्पन्न हुए थे जैसा कि पहले वर्णित है30,31. संक्षेप में, पैकेजिंग प्लास्मिड psPAX2 (एड्स रिसोर्स एंड रिएजेंट प्रोग्राम), लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर प्लास्मिड pLenti-CMV Puro-Luc (Addgene), और स्पाइक प्रोटीन जो PCDNA3.1-SARS CoV-2 SΔCT को व्यक्त करते हैं, को HEK293T कोशिकाओं में सह-ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। लिपोफ़ेक्टामाइन 2000 (थर्मोफ़िशर)। SARS-CoV-2 वेरिएंट के स्यूडोवायरस WA1/2020 स्ट्रेन (वुहान/WIV04/2019, GISAID परिग्रहण आईडी: EPI_ISL_402124), B.1.617.2 (डेल्टा, GISAID परिग्रहण आईडी: EPI_ISL_2020950), या B.1.1 का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। 529 (ओमाइक्रोन, GISAID आईडी: EPI_ISL_7358094.2)। स्यूडोटाइप वायरस वाले सतह पर तैरनेवाला 48 घंटे के बाद अभिकर्मक एकत्र किए गए थे, जिन्हें 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ सेंट्रीफ्यूजेशन और निस्पंदन द्वारा शुद्ध किया गया था। सीरम नमूनों की निष्क्रियता गतिविधि का निर्धारण करने के लिए, HEK293T-hACE2 कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटों में 2 × 10 के घनत्व पर रखा गया था।4 कोशिकाओं/अच्छी तरह से रात भर। गर्मी निष्क्रिय सीरम के नमूनों के तीन गुना सीरियल dilutions तैयार किए गए और स्यूडोवायरस के 50 μl के साथ मिलाया गया। HEK293T-hACE2 कोशिकाओं के अलावा मिश्रण को 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। 48 घंटे के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं को स्टेडी-ग्लोस लूसिफ़ेरेज़ परख (पेमरेगा) में lysed किया गया था। SARS-CoV-2 न्यूट्रलाइजेशन टाइटर्स को नमूना कमजोर पड़ने के रूप में परिभाषित किया गया था, जिस पर वायरस नियंत्रण कुओं के औसत के सापेक्ष सापेक्ष प्रकाश इकाई (RLU) में 50% की कमी देखी गई थी।

स्प्लेनोसाइट रीस्टिम्यूलेशन, इंट्रासेल्युलर साइटोकाइन स्टेनिंग और फ्लो साइटोमेट्री

माउस स्प्लेन्स को यंत्रवत् रूप से अलग कर दिया गया और 70 माइक्रोन सेल स्ट्रेनर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, कोशिकाओं को आरटी पर 2 मिनट के लिए 1 एमएल अमोनियम-क्लोराइड-पोटेशियम लसीका बफर के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को 96-अच्छी तरह से यू-बॉटम प्लेट (2 × 10 .) में धोया और चढ़ाया गया था6/ अच्छी तरह से) और 10% गर्मी-निष्क्रिय एफबीएस, पेनिसिलिन (100 यू / एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 मिलीग्राम / एमएल), 2-मर्कैप्टोएथेनॉल (55 मिमी), गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (60 मिमी) के साथ पूरक आरपीएमआई 1640 में रातोंरात ऊष्मायन किया गया। ), HEPES (11 मिमी), और एल-ग्लूटामाइन (800 मिमी) (सभी गिब्को)। अगले दिन, SARS-CoV-2 वाइल्डटाइप (PM-WCPV-S-1) या Omicron (PM-SARS2-SMUT08-1) स्पाइक पेप्टाइड पूल (JPT) को एंटी-माउस CD28 की उपस्थिति में 0.6 nmol/ml पर जोड़ा गया। /49d (1 μg/mL, BD) और ब्रेफेल्डिन A (5 μg/ml, BioLegend)। 6 घंटे की उत्तेजना के बाद, कोशिकाओं को दो बार धोया गया और निर्माता के निर्देशों के अनुसार माउस एफसी ब्लॉक (बीडी) के साथ इलाज किया गया। आरटी पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं को एक्वा लाइव / डेड स्टेन (लाइफ टेक्नोलॉजीज, 1: 500) से धोया और दाग दिया गया। दो अतिरिक्त washes के बाद, कोशिकाओं को निम्नलिखित ABS के साथ 4 ° C पर 30 मिनट के लिए ऊष्मायन किया गया: एंटी-माउस CD44 [IM7, PerCP-Cy5.5, BioLegend #103032, 1:160]एंटी-माउस सीडी3 [17A2, Brilliant Violet 785, BioLegend #100232, 1:40]एंटी-माउस सीडी4 [RM4-5, APC/Fire 750, BioLegend 100568, 1:160] और विरोधी माउस CD8 [53-6.7, Brilliant UltraViolet 395, BD #563786, 1:80]. कोशिकाओं को तब निर्माता के निर्देशों के अनुसार BD Cytofix / Cytoperm किट का उपयोग करके तय और पारगम्य किया गया था, और निम्नलिखित ABS का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर धुंधला (4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) के अधीन किया गया था: एंटी-माउस IFNγ [XMG1.2, Alexa Fluor 488, BioLegend #505813, 1:160]एंटी-माउस TNF [MP6-XT22, PE Cy7, BioLegend # 506324, 1:160]एंटी-माउस IL-2 [JES6-5H4, PE, BioLegend # 503808, 1:40]. अंत में, कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 1% पैराफॉर्मलडिहाइड (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंसेज) में तय किया गया और अधिग्रहण तक पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया। नमूनों का विश्लेषण एलएसआर II (बीडी) प्रवाह साइटोमीटर और फ्लोजो v10.8.1 (फ्लोजो एलएलसी) पर किया गया था।

SARS-CoV-2 ओमाइक्रोन चुनौती अध्ययन

पीबीएस में पतला 50 μL केटामाइन (1.3 मिलीग्राम / माउस) और xylazine (0.38 मिलीग्राम / माउस) के साथ चूहे को इंटरपेरिटोनियल रूप से संवेदनाहारी किया गया था। चूहे को तब 1 × 10 . के साथ आंतरिक रूप से टीका लगाया गया था5 सार्स-सीओवी-2 ओमाइक्रोन (बीए.1) का पीएफयू, डॉ. मेहुल सुथार के सौजन्य से, पीबीएस के 50 μL में नार के बीच विभाजित। चुनौती वाले चूहों को प्रतिदिन तौला गया। संक्रमण के 2 दिन बाद, चूहों को euthanized किया गया था, और फेफड़ों को ऊतक विज्ञान के लिए काटा गया था, qPCR द्वारा मेजबान प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण, और पट्टिका परख द्वारा वायरल अनुमापांक का निर्धारण।

SARS-CoV-2 पट्टिका परख

संक्रमण से एक दिन पहले, 2.5e5 VeroTMPRSS2 कोशिकाओं को VeroTMPRSS2 मीडिया के 1 mL में 12-वेल प्लेट में प्रति कुएं में बीज दिया गया था। [DMEM (Quality Biological), 10% FBS (Gibco), 1% Penicillin-Streptomycin (Gemini Bio Products), and 1% L-Glutamine (Gibco)]. बीड रप्टर (ओमनी इंटरनेशनल इंक) में 1 मिमी मोतियों के साथ ऊतक के नमूनों को पिघलाया और समरूप बनाया गया और फिर 2 मिनट के लिए 21,000 ग्राम पर काता गया। 225 μL DMEM में नमूना 1:10 के 25 μL को सीरियल पतला करके एक 6-बिंदु कमजोर पड़ने वाला वक्र तैयार किया गया था। प्रत्येक कमजोर पड़ने के 200 μL को तब कोशिकाओं में जोड़ा गया था और प्लेटों को हर 15 मिनट में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाया गया था। 1 घंटे के बाद, प्रत्येक कुएं में 2 एमएल अर्ध-ठोस agarose उपरिशायी जोड़ा गया [DMEM, 4% FBS, and 0.06% UltraPure agarose (Invitrogen)]. 72 घंटे के बाद 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2प्लेटों को 20 मिनट के लिए 2% पीएफए ​​​​में तय किया गया था, 0.5 एमएल 0.05% क्रिस्टल वायलेट और 20% EtOH के साथ दाग दिया गया था, और एच के साथ दो बार धोया गया था।2ओ पट्टिकाओं की गिनती से पहले। इसके बाद टिटर की गणना की गई। ऊतक समरूपों के लिए, इस अनुमापांक को 40 से गुणा किया गया था जो औसत ऊतक नमूना वजन 25 मिलीग्राम के आधार पर था।

qPCR . द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण

निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार फिनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण या स्तंभ-आधारित निष्कर्षण प्रणाली (डायरेक्ट-ज़ोल आरएनए मिनिप्रेप, ज़ाइमो रिसर्च) का उपयोग करके आरएनए को टीआरआई अभिकर्मक नमूनों से अलग किया गया था। आरएनए एकाग्रता और शुद्धता (260/280 और 260/230 अनुपात) को नैनोड्रॉप (थर्मो फिशर साइंटिफिक) द्वारा मापा गया था। आगे के विश्लेषण के लिए <1.7 के A260/A280 अनुपात वाले नमूनों को बाहर रखा गया। सीडीएनए शुद्ध आरएनए से आरटी . के साथ तैयार किया गया था2 निर्माता के निर्देशों (क्यूजेन) के अनुसार फर्स्ट स्ट्रैंड किट। सीडीएनए को qPCR द्वारा 7300 रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) पर पूर्व-डिज़ाइन किए गए SYBR ग्रीन प्राइमर्स (QIAGEN) का उपयोग करके निर्धारित किया गया था फिट2 (पीपीएम05993ए), Rsad2 (पीपीएम26539ए), और आरपीएल13ए (पीपीएम03694ए)।

सांख्यिकी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता

माउस प्रयोगों का उद्देश्य प्रति समूह कुल 20 चूहों को शामिल करना था और एकल प्रयोगों से थे। पिछले अध्ययनों के परिणामों के आधार पर नमूना आकार और आयु मानदंड अनुभवजन्य रूप से चुने गए थे। चूहों को बेतरतीब ढंग से विभिन्न उपचार समूहों को सौंपा गया था। किसी भी डेटा आउटलेयर को बाहर नहीं किया गया था। प्रिज्म v9.0.2 (ग्राफपैड सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किए गए थे। दो पूंछ पी मान <0.05 महत्वपूर्ण माने गए। आम तौर पर वितरित डेटा का विश्लेषण कई तुलनाओं के लिए सही किए गए विचरण (ANOVAs) के एकतरफा विश्लेषण द्वारा किया गया था। गैर-सामान्य रूप से वितरित डेटा को एनोवा द्वारा लॉग-रूपांतरित और विश्लेषण किया गया था या कई तुलनाओं के लिए क्रुस्कल-वालिस परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गया था।

रिपोर्टिंग सारांश

अनुसंधान डिजाइन के बारे में अधिक जानकारी इस आलेख से जुड़े प्रकृति अनुसंधान रिपोर्टिंग सारांश में उपलब्ध है।

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