माइक्रोबियल सेल-मुक्त डीएनए की अगली पीढ़ी के प्लाज्मा मेटागेनोमिक अनुक्रमण संदिग्ध संक्रमित अग्नाशय परिगलन वाले रोगियों में रोगजनकों का पता लगाता है | बीएमसी संक्रामक रोग

माइक्रोबियल सेल-मुक्त डीएनए की अगली पीढ़ी के प्लाज्मा मेटागेनोमिक अनुक्रमण संदिग्ध संक्रमित अग्नाशय परिगलन वाले रोगियों में रोगजनकों का पता लगाता है |  बीएमसी संक्रामक रोग

अध्ययन डिजाइन और नैतिकता

यह नानजिंग जिनलिंग अस्पताल में आयोजित एक पूर्वव्यापी डेटाबेस-आधारित कोहोर्ट अध्ययन है। डेटाबेस की स्थापना को नानजिंग जिनलिंग अस्पताल (2019NZKY009-01) की संस्थागत नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। अकादमिक अनुसंधान के लिए नैदानिक ​​और प्रयोगशाला डेटा का उपयोग करने पर प्रत्येक प्रतिभागी से व्यापक सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। नैदानिक ​​​​और प्रयोगशाला डेटा को एक वेब-आधारित इलेक्ट्रॉनिक डेटाबेस (एक्यूट पैन्क्रियाटाइटिस डेटाबेस) में एकत्र और संग्रहीत किया गया था।

रोगी चयन

अक्टूबर 2020 से अक्टूबर 2021 तक गंभीर तीव्र अग्नाशयशोथ (सीएसएपी), जिनलिंग अस्पताल (नानजिंग, चीन) के केंद्र में भर्ती एपी के निदान वाले वयस्क विषयों की जांच की गई। एपी के निदान और गंभीरता को संशोधित अटलांटा वर्गीकरण 2012 के अनुसार परिभाषित किया गया था [19].

समावेशन मानदंड इस प्रकार थे: (1) प्लाज्मा एमएनजीएस तब किया गया था जब आईपीएन पर संदेह था लेकिन अभी तक इसकी पुष्टि नहीं हुई थी। संदिग्ध आईपीएन नैदानिक ​​​​अभिव्यक्तियों पर आधारित था जैसे कि ऊंचा सूजन मार्करों के साथ बुखार। एमएनजीएस परीक्षण का निर्णय उपचार करने वाले चिकित्सक द्वारा किया जाता है। (2) एपी शुरुआत से नमूना लेना <35 दिन। (3) नमूना लेने के 14 दिनों से अधिक समय बाद जीवित रहा। बहिष्करण मानदंड गर्भावस्था थे और स्क्रीनिंग में अतिरिक्त-अग्नाशयी संक्रामक जटिलताओं की पुष्टि की गई थी।

मेटागेनोमिक अगली पीढ़ी की अनुक्रमण और विश्लेषण

पूरे रक्त के नमूने (3–5 मिली) PACEseq mNGS विश्लेषण (ह्यूगोबायोटेक, बीजिंग, चीन) के लिए भेजे गए थे। प्रत्येक नमूने की मानव कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया गया था। सतह पर तैरनेवाला अपने मैनुअल के आधार पर TIANGEN DP316 किट (TIANGEN, बीजिंग, चीन) का उपयोग करके डीएनए निष्कर्षण के लिए एकत्र किया गया था। NEBNext अल्ट्रा II डीएनए लाइब्रेरी प्रेप किट (NEB, इप्सविच, यूके) का उपयोग तब निर्माता के निर्देशों के अनुसार डीएनए लाइब्रेरी के निर्माण के लिए किया गया था। सभी पुस्तकालयों की गुणवत्ता को क्यूबिट (थर्मो फिशर साइंटिफिक, एमए, यूएसए) और एगिलेंट 2100 बायोएनालिज़र (एगिलेंट टेक्नोलॉजीज, पालो ऑल्टो, यूएसए) द्वारा मापा गया था। योग्य पुस्तकालयों को अंततः नेक्स्टसेक 550 प्लेटफॉर्म (इलुमिना, सैन डिएगो, यूएसए) पर अनुक्रमित किया गया। प्रयोगों के दौरान प्रत्येक बैच के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण निर्धारित किए गए थे। कच्चे डेटा का विश्लेषण PACEseq (ह्यूगोबायोटेक, बीजिंग) पर किया गया था। एडेप्टर, साथ ही निम्न गुणवत्ता, कम-जटिलता, और लघु रीड्स (35 बीपी से कम) को कच्चे डेटा से हटा दिया गया था। SNAP और बुरो-व्हीलर संरेखण को मानव संदर्भ जीनोम (hg38) में रीड्स को मैप करके मानव अनुक्रमों को बाहर करने के लिए लागू किया गया था। स्क्रीन किए गए अनुक्रमों को अंततः NCBI Refseq डेटाबेस (//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq) के साथ पंजीकृत सूक्ष्मजीवों (बैक्टीरिया, वायरस, कवक, प्रोटोजोआ, और अन्य बहुकोशिकीय यूकेरियोटिक रोगजनकों) जीनोम डेटा के लिए मैप किया गया था। /)। ज्ञात रोगजनक सूक्ष्मजीवों के सभी मापदंडों की गणना की गई, जिसमें अनुक्रम पढ़ता है, सापेक्ष बहुतायत, जीनोम कवरेज और गहराई शामिल है। प्रत्येक ज्ञात रोगज़नक़ की रीड संख्या और रीड प्रति मिलियन (RPM) की गणना की गई। बैक्टीरिया सहित पता लगाए गए रोगाणुओं के लिए (माइक्रोबैक्टीरिया अपवर्जित), और कवक (क्रिप्टोकोकस बहिष्कृत), एक सकारात्मक एमएनजीएस परिणाम तब दिया गया जब इसका कवरेज एक ही तरह के रोगाणुओं के शीर्ष 10 में था और नकारात्मक नियंत्रण (“कोई टेम्पलेट नहीं” नियंत्रण, एनटीसी) में अनुपस्थित था या जब नमूना और एनटीसी (आरपीएम के बीच आरपीएम का इसका अनुपात)नमूना/आरपीएमएनटीसी) > 10 अगर आरपीएमएनटीसी0. के लिए एम तपेदिकतथा क्रिप्टोकोकसएक सकारात्मक mNGS परिणाम पर तब विचार किया गया जब कम से कम 1 अद्वितीय रीड को प्रजातियों के स्तर पर मैप किया गया और NTC या RPM में अनुपस्थित थानमूना/आरपीएमएनटीसी> 5 जब आरपीएमएनटीसी0 [20]. चूंकि पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा वायरस अनुक्रम सत्यापित नहीं किया गया था, जिन मामलों में केवल वायरस अनुक्रम का पता चला था उन्हें एमएनजीएस नकारात्मक के रूप में परिभाषित किया गया था।

माइक्रोबियल कल्चर

सभी रोगियों के रक्त के नमूने उसी समय माइक्रोबियल कल्चर के लिए भेजे गए थे जब एमएनजीएस परीक्षण किया गया था। निर्माता के मैनुअल के अनुसार ब्लड कल्चर (BC) इंस्ट्रूमेंट BD BACTECTMFX40 (बेक्टन डिकिंसन) का उपयोग करके रक्त के नमूनों का विश्लेषण किया गया। विटेक एमएस सिस्टम (बायोमेरीक्स, संस्करण 1.7, फ्रांस) का उपयोग करके सकारात्मक रक्त संस्कृति के नमूनों का अनुमान लगाया गया था।

रोगजनकों को ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया, ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया और कवक के अनुसार वर्गीकृत किया जाता है। पॉलीमाइक्रोबियल संक्रमण को एक नमूने में पाए गए एक से अधिक रोगज़नक़ों के रूप में परिभाषित किया गया था।

पुष्टिकारक आईपीएन का निदान

इस अध्ययन में, नमूना लेने के दो सप्ताह के भीतर आईपीएन के पुष्टिकरण निदान को संदर्भ मानक माना गया। आईपीएन की पुष्टि तब हुई जब (पेरी) अग्नाशयी नालियों से परक्यूटेनियस फाइन-सुई एस्पिरेशन या ड्रेनेज प्रक्रियाओं और/या ऑपरेटिव नेक्रोसेक्टॉमी के दौरान एक सकारात्मक माइक्रोबियल कल्चर प्राप्त किया गया। अन्यथा, स्टेराइल पैंक्रियाटिक नेक्रोसिस (एसपीएन) को परिभाषित किया जाएगा। आक्रामक हस्तक्षेप का निर्णय उपचार करने वाले चिकित्सक द्वारा तय किया जाता है।

नैदानिक ​​​​परिणाम और परिभाषाएँ

नैदानिक ​​​​परिणाम उपायों में अस्पताल में मृत्यु दर, अस्पताल में रहने की अवधि (एलओएस), आईसीयू में प्रवेश की आवश्यकता, संशोधित मार्शल के स्कोर के आधार पर नए-शुरुआत अंग विफलता शामिल हैं। [19]सेप्सिस 3.0 परिभाषाओं के अनुसार परिभाषित न्यू-ऑनसेट सेप्सिस, और सेप्टिक शॉक [21]प्रबंधन से संबंधित उपाय, और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फिस्टुला या पेट से खून बह रहा है जिसमें आक्रामक हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है [22]. इस अध्ययन में ‘नई शुरुआत’ को उन घटनाओं के रूप में परिभाषित किया गया था जो नमूना लेने के बाद हुई थीं और नमूना लेने से 24 घंटे पहले मौजूद नहीं थीं।

डेटा निकालना

डेटा को पहले से विकसित डेटा एक्सट्रैक्शन फॉर्म का उपयोग करके निकाला गया था। आयु, लिंग, एटियलजि, प्रयोगशाला जैव रसायन, और एक्यूट फिजियोलॉजी और क्रॉनिक हेल्थ इवैल्यूएशन II (APACHE II) स्कोर, कंप्यूटेड टोमोग्राफी (सीटी) गंभीरता सूचकांक, और अनुक्रमिक अंग विफलता मूल्यांकन (SOFA) जैसे नैदानिक ​​​​स्कोर सहित जनसांख्यिकीय और आधारभूत नैदानिक ​​​​विशेषताओं से संबंधित डेटा। ) स्क्रीनिंग के स्कोर को डेटाबेस से निकाला गया। रोगजनकों की पहचान के लिए, मानक रिपोर्ट के आधार पर एमएनजीएस परिणाम एकत्र किए गए थे। विश्लेषण से पहले, डेटा की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए प्रमुख जांचकर्ताओं द्वारा डेटा पर क्रॉस-चेकिंग की गई थी।

सांख्यिकीय विश्लेषण

प्लाज्मा एमएनजीएस परीक्षणों के समग्र परिणामों को वास्तविक सकारात्मक (टीपी), झूठी सकारात्मक (एफपी), वास्तविक नकारात्मक (टीएन), या झूठी नकारात्मक (एफएन) के रूप में घोषित किया जाएगा, जैसा कि पिछले अध्ययनों में बताया गया है। [23, 24]. समग्र परिणाम को वास्तविक सकारात्मक माना जाता था यदि प्लाज्मा mNGS ने कम से कम एक IPN-प्रासंगिक जीव का पता लगाया, जबकि प्लाज्मा mNGS ने रोगजनकों का पता लगाया जो IPN निदान के अनुसार नहीं थे, तो इसे गलत सकारात्मक माना जाता था। हमने सकारात्मक प्रतिशत समझौते (पीपीए) और नकारात्मक प्रतिशत समझौते (एनपीए) का अनुमान लगाने के लिए उपर्युक्त संदर्भ मानक का उपयोग किया। परिणाम 95% सीआई . के साथ प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट किए गए थे [25].

इंटरक्वेर्टाइल रेंज (25%, 75%) के साथ माध्यिका के रूप में निरंतर चर की सूचना दी गई थी। श्रेणीबद्ध चर आवृत्तियों और प्रतिशत में व्यक्त किए गए थे। मान-व्हिटनी यू परीक्षणों का उपयोग निरंतर चर के लिए समूहों के बीच अंतर की तुलना करने के लिए किया गया था। श्रेणीबद्ध चर की तुलना करने के लिए फिशर के सटीक परीक्षणों का उपयोग किया गया था। डेटा विश्लेषण के लिए SPSS 26 और ग्राफ़्ड प्रिज़्म7 सॉफ़्टवेयर लागू किए गए हैं। सभी परीक्षण दो-पूंछ वाले थे, और 0.05 से कम के पी-मानों को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था।

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